Криопротокол что это: Схемы криопротоколов — в естественном цикле и на згт

Содержание

Криопротокол в Ростове-на-Дону, цена и отзывы

Технологии экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) динамично развиваются в направлении повышения результативности и безопасности. Сегодня этим требованиям отвечает криопротокол ЭКО, который носит название «Сегментированный». 

В сегментированном протоколе процесс получения эмбрионов, а также их замораживание (криоконсервация) проводятся в одном цикле, а перенос в матку — в другом. Это даёт возможность женщине отдохнуть после процедуры стимуляции суперовуляции и пункции, а специалистам — подготовить эндометрий матки к имплантации.

Данные исследований и опыт ведущих мировых клиник показывают, что криоконсервация благотворно влияет на эмбрион.

Результативность сегментированных криопротоколов  в группе пациенток до 34-х лет превышает 50%.

Успешность ЭКО с криоконсервацией обеспечивает ряд факторов: 1. Применяется самая передовая технология криоконсервации — витрификация. Происходит сверхбыстрое замораживание, при котором сохраняется качество эмбрионов.

2. Криоконсервации подвергаются лучшие 5-6-дневные эмбрионы. В это время они достигают стадии бластоцисты. На этом этапе зародыши обладают высокими имплантационными свойствми, а эмбриологи могут тщательно исследовать их морфологию, геном и оценить жизненный потенциал.

3. Проводится тщательная подготовка эндометрия к принятию эмбриона. Уровень квалификации врачей и УЗИ аппараты экспертного класса позволяет с высокой точностью определить «окно имплантации» — самое благоприятное время для переноса, что существенно увеличивает шансы наступления беременности.

4. Дозировка гормонов при стимуляции суперовуляции рассчитывается индивидуально с максимальной точностью и корректируется репродуктологом в процессе наблюдения за созреванием фолликулов. Специалистам «ГЕНОМ» обычно удаётся получить адекватный ответ яичников даже при минимальном гормональном воздействии, сократить риски побочных эффектов и получить качественные яйцеклетки.


Когда нужна криоконсервация эмбрионов — «Центр ЭКО» Брянск

К сожалению, далеко не каждая попытка забеременеть методом ЭКО бывает успешной. По статистике, в среднем беременность наступает и положительно развивается лишь в 30-65% случаев. В случае неудачи женщина вынуждена снова пройти через повторную процедуру стимуляции яичников и пункции фолликулов, которая сопровождается активной гормональной терапией.

Своеобразной страховкой пациентки на случай неудачи может служить замораживание в жидком азоте эмбрионов. Первый ребенок из замороженного эмбриона человека был рожден в 1984 г. в Голландии. Доказано, что перенос свежих и размороженных оплодотворенных яйцеклеток имеет практически равные шансы на наступление беременности. Конечно, не каждый эмбрион благополучно «переживет» этапы заморозки и разморозки. Часть эмбрионов (до 30%) разрушается, но оставшаяся часть – это эмбрионы высшего качества, которые могут быть успешно использованы для повторной подсадки. При этом криопротокол, в который включено хранение, разморозка и подсадка – гораздо дешевле, чем новая попытка ЭКО. И, что немаловажно, криопротокол избавляет от необходимости проведения повторной стимуляции суперовуляции, а значит – снимает чрезмерную медикаментозную нагрузку на женский организм.

Криопротокол также рекомендуется пациентам с повышенным риском развития синдрома гиперстимуляции яичников, тяжелые формы которого приводят к серьезным осложнениям вплоть до угрозы жизни.

Кроме того, в случае наступления беременности в свежем протоколе и благополучного рождения здорового ребенка, семейная пара имеет возможность через какое-то время прийти за вторым и последующим ребенком. У криоконсервированных эмбрионов не существует «срока годности» в общепринятом смысле.

Регламентированных сроков хранения замороженного материала для зачатия пока нет. Но в ряде стран они ограничены 5 годами. В Израиле известны случаи успешного наступления беременности после 12-летнего хранения эмбрионов.

Время хранения определяет пациент, оплачивая нахождение эмбриона в криобанке заранее. Очень важно помнить, что по завершению оплаченного срока хранения эмбриона пациент должен принять решение о его судьбе. Среди возможных вариантов – продление срока хранения, перенос эмбриона в матку, его утилизация либо же передача эмбриона для донации супружеской паре или для научных исследований.

Шансы на наступление беременности при переносе размороженного эмбриона – такие же, как и при подсадке свежего. Так как для криоконсервации выбирают только эмбрионы хорошего качества и в процессе размораживания выживают «сильнейшие»– шанс забеременеть даже увеличивается. В нашей клинике используется метод витрификации эмбрионов, который по данным литературы демонстрирует высокий процент успешной беременности – аналогичный стандартному протоколу ЭКО.

Самый частый вопрос, волнующий родителей — а какой ребенок разовьется из криоконсервированного эмбриона? Не будет ли он иметь каких-либо отклонений в развитии? А некоторые семейные пары категорически отказываются от криоконсервации, говоря — не нужны нам эти «замороженные» дети… На этот счет можно сказать только то, что по данным различных исследований дети, рожденные из размороженных эмбрионов, страдают патологиями не чаще детей, рожденных путем естественного зачатия.

Криоконсервация эмбрионов — выдающееся научное достижение в области вспомогательных репродуктивных технологий, которое открывает двери в мир практически неограниченных возможностей зачатия.

Криопротокол — Evaclinic IVF

Главное отличие криопротокола от обычного протокола ЭКО в отсутствии этапов гормональной стимуляции и пункции яичников. В криопротоколе в матку переносят размороженные эмбрионы, которые хранились в криоконсервированном виде. Здесь Вы можете ознакомиться с информацией на сайте.

Откуда берутся эмбрионы? Благодаря гормональной стимуляции в рамках протокола ЭКО, у женщины созревает много фолликулов (в среднем от 8 до 15). Лучшие из них отбираются для последующего оплодотворения, и это дает возможность получить сразу несколько эмбрионов. В одном протоколе в матку можно перенести 1-2 эмбриона (для женщины до 35 лет) и 1-3 эмбриона (для женщины старше 35 лет). Оставшиеся эмбрионы пара может заморозить для последующих попыток.

Эмбрионы консервируются с помощью современной технологии – витрификации. Это ультрабыстрая заморозка, при которой кристаллы льда просто не успевают образоваться, а значит процент выживаемости эмбрионов при оттаивании превышает 90%.

Главные этапы криопротокола:

Обследование женщины (конкретный список будет зависеть от того, сколько времени прошло с предыдущей попытки, возможно, придется пересдавать только часть анализов).

Подготовка к переносу эмбрионов (криопротокол может проводиться, как в естественном цикле, так и с назначением гормональной терапии. Этот вопрос репродуктолог решает индивидуально для каждой клиентки).

Размораживание эмбрионов.

Перенос эмбрионов в полость матки.

Гормональная поддержка лютеиновой фазы (для поддержки беременности женщине дополнительно назначают прием препаратов прогестерона).

Проведение теста для определения беременности (анализ на ХГЧ можно сдавать уже на 10 день после подсадки, а вот тест лучше делать в первые дни задержки).

Важно: эффективность криопротокола в целом сопоставима с протоколами, в которых в матку переносят «свежие» эмбрионы. Более того, последние исследования показали, что шансы наступления беременности в криопротоколе немного выше, поскольку для криоконсервации выбираются самые жизнеспособные и крепкие эмбрионы.

Узнать подробности о криопротоколе и записаться на консультацию к репродуктологу Вы можете на сайте или по телефону 409.

Клиника ЭКО | Неделя знаний о криопротоколе

Сентябрь по всей стране начинается со Дня знаний. С 1 сентября по 12 сентября 2005 года в рамках акции «Неделя знаний о криопротоколе» врачи Медицинской Клиники Репродукции МАМА ответят на любые ваши вопросы о лечении методом ЭКО с использованием замороженных эмбрионов. Все, что вы хотели узнать, вы можете спросить у врачей-репродуктологов Клиники МАМА. Все, что вы хотели узнать, вы можете спросить у врачей-репродуктологов Клиники МАМА по электронной почте [email protected]» title=»Написать письмо»>[email protected] . Читайте вопросы посетителей сайта.

Сентябрь по всей стране начинается со Дня знаний. С 1 сентября по 12 сентября 2005 года в рамках акции «Неделя знаний о криопротоколе» врачи Медицинской Клиники Репродукции МАМА ответят на любые ваши вопросы о лечении методом ЭКО с использованием замороженных эмбрионов. Все, что вы хотели узнать, вы можете спросить у врачей-репродуктологов Клиники МАМА. Все, что вы хотели узнать, вы можете спросить у врачей-репродуктологов Клиники МАМА по электронной почте [email protected] . Читайте вопросы посетителей сайта.

1. У меня только что закончился неудачей первый протокол, остались криошки, три штучки. Как скоро я могу снова начать крио протокол, нужно ли отдыхать после первого протокола? Спасибо. Наталья.

Наташа, здравствуйте!Формально Вы можете начать крио- протокол через один менструальный цикл. Но это лишь в том случае, если Ваш лечащий доктор, оценив данные УЗИ, решит, что яичники отдохнули от проведенной стимуляции. Возможно, Вам будут назначены дополнительные дообследования. Это тоже займет некоторое время.Удачи Вам!

Татьяна Сергеевна СухачеваЗав. диагностическим отделением, врач-репродуктологМедицинской Клиники Репродукции МАМА .2. Хочу пойти на крио протокол, как можно скорее. Неудачный протокол был «длинный» в августе 2005 года. Подсаживали 3 эмбриона. осталось замороженныими тоже 3. Когда идти и как подготовиться?

Торопиться не стоит. Идти в крио протокол можно, как только Вы согласуете сроки с лечащим врачом: для этого необходимо, чтобы Вы прошли консультацию и осмотр ПОСЛЕ неудачного протокола. И было проведено соответствующее вашей ситуации дообследование причин неудач. Вероятно в Вашем случае врач будет искать причину(ы) отсутствия имплантации эмбрионов в матке.

Виктория Викторовна Залетова Главный врач Медицинской Клиники Репродукции МАМА

3.Два года назад неудачная попытка ЭКО, через неделю назначили крио перенос,но врач и эмбриолог считают, что скорее всего результата не будет, так как прошло 2 года и жизнедеятельность эмбрионов значительно снижена. Пожалуйста, подскажите, где можно получить полную информацию о крио переносе. И действительно ли это так? Очень тяжело столкнуться опять с отрицательным результатом. Тем более возраст поджимает — мне 31 год, мужу — 38. С нетерпением жду ответа!

В каждом лечебном учреждении, практикующем ЭКО, имеются свои наработки. Оценка успешного прогноза криопротокола провордится заранее, до переноса: качество эмбрионов до замораживания, условия и сроки их хранения, качество эмбрионов после размораживания, готовность женщины к переносу (гинекологическая составляющая и общее состояние здоровья). Насколько можно судить по вашему письму жизнедеятельность эмбрионов значительно снижена вследствие какого-то фактора. На этот вопрос может ответить только лечащий врач/главный врач вашего Центра ЭКО.

Виктория Викторовна Залетова Главный врач Медицинской Клиники Репродукции МАМА

4. Почему эмбриончиков замораживают не по одному, а по 2-3, ведь теоретически, при разморозке сразу трех эмбрионов, все три могут оказаться пригодными для переноса, а подсадить можно только двух (третий — пропадает)?

Методика в клинике, проверенная временем и эффективностью, предполагает замораживание эмбрионов в одной паете от 1 до 3. В зависимости от качества и общего количества полученных эмбрионов у данной супружеской пары.

Виктория Викторовна Залетова Главный врач Медицинской Клиники Репродукции МАМА

5.Как долго размораживают эмбриончиков и через какой период времени их можно подсаживать?

Эмбрионы размораживаются в соответствии со стадией цикла женщины и возрастом эмбрионов. Это определяется лечащим врачом.

Виктория Викторовна Залетова Главный врач Медицинской Клиники Репродукции МАМА

6. Есть ли смысл идти в криопротокол при наличии только 2-х криошек?

Да. Конечно.

Виктория Викторовна Залетова Главный врач Медицинской Клиники Репродукции МАМА

7. Хочу задать вопрос по размораживанию змбрионов. За сколько часов до переноса необходимо начать размораживание; через какой интервал времени можно судить о качестве размороженных эмбрионов? Спасибо.

Размораживание эмбрионов происходит, как правило, за 1-1,8 суток, но иногда немного позже. Это зависит от стадии и качества замороженных эмбрионов. О качестве эмбрионов в целом можно судить сразу же после размораживания, а также отследить стадии их развития.

Татьяна Сергеевна СухачеваЗав. диагностическим отделением, врач-репродуктологМедицинской Клиники Репродукции МАМА .

8. Проходила попытку ЭКО в январе 2003 году в вашей клинике. У меня поликистоз. Была гиперстимуляция и перенос эмбрионов мне тогда отменили. У меня остались 5 замороженных эмбрионов. Меня волнует вопрос, можно ли их подсадить и не плохие ли они после стольких лет хранения. Алена.

Алена, Ваши эмбрионы были заморожены в клинике » МАМА» в 2003 году в отличном состоянии. По нашим данным выживаемость эмбрионов остается хорошей в течении двух лет и составляет более 80%. Вам нужно обратиться к лечащему врачу, поскольку Ваш гормональный фон изменен при поликистозе. Вы нуждаетесь в общей подготовке к беременности, коррекции перевеса в Вашем организме мужских гормонов и стимуляции овуляции в криопротоколе для создания нормального овуляторного цикла.

Лариса Сергеевна Якунинаврач-репродуктологМедицинской Клиники Репродукции МАМА .

9. Живу в другом городе. У меня цикл постоянно нерегулярный. Уже 2 раза собиралась начать криоцикл, но всегда ошибалась с началом менструации на несколько дней, поэтому приходилось сдавать билеты. Ехать мне до Москвы 1 сутки. Как мне спланировать свое лечение? Татьяна.

Татьяна, вам необходимо связаться с лечащим врачом за 1 месяц до предполагаемого приезда в клинику. По месту жительства Вы пройдете несколько УЗИ в течение этого месяца подготовки, сдадите анализы к ЭКО и на гормоны. Врач клиники «МАМА» подберет поддержку на этот период таким образом, чтобы менструация началась в срок через 27-29 дней считая дни от последней менструации. Брать билеты можно на эти последние дни цикла подготовки.

Лариса Сергеевна Якунинаврач-репродуктологМедицинской Клиники Репродукции МАМА .

10. Есть ли смысл крио-эмбрионов (замороженных на стадии 4-6 клеточных) доращивать до бластоцист? Проводится ли такое «доращивание» в Маме?

И да и нет. Все зависит от ситуации у супругов. Если «хорошие» эмбрионы «хорошо» пережили замораживание и развиваются далее, то ждать до бластоцист не имеет смыла. В случае большого числа не развивающихся эмбрионов после разморозки у данной супружеской пары имеет смысл культивировать живые эмбрионы до бластоцист, чтобы выбрать лучшие.

Виктория Викторовна Залетова Главный врач Медицинской Клиники Репродукции МАМА

11. У меня после первого неудачного протокола осталось четыре КРИОэмбриона. Перед началом КРИОпротокола выяснилось, что у меня ТТГ ниже нормы (0,02 при норме 0,27 — 4,2). Так вот. Можно ли, несмотря на низкий ТТГ, начинать КРИОпротокол?

Начинать криопротокол можно при условии стабильной работы щитовидной железы. То есть, идти в протокол без консультации эндокринолога и коррекции гормонального фона не стоит.

Виктория Викторовна Залетова Главный врач Медицинской Клиники Репродукции МАМА

Сделайте первый шаг — запишитесь на прием!

Ознакомьтесь с текстом по ссылке

Y N

Сохранение яйцеклеток, спермы, эмбрионов. Криоконсервация

Криоконсервация

В Клинике Доктора Фомина для сохранения женских и мужских половых клеток, а также  эмбрионов, применяется современная и безопасная технология криоконсервации («заморозки») – витрификация. Это сверхбыстрая бережная заморозка, которая препятствует образованию в биоматериалах острых кристаллов льда. Благодаря чему, половые клетки и эмбрионы могут храниться сколь угодно долгий срок и также безопасно быть разморожены.

Криобанк

Система хранения и учета половых клеток и эмбрионов в высокотехнологичном криобанке Клиники Доктора Фомина надежна и безопасна!

Биоматериалы хранятся в криохранилище в сосудах Дьюара при температуре -196 градусов. Контроль уровня азота производится специализированными датчиками, которыми снабжен каждый сосуд.

Функционируют резервные системы подачи электроснабжения, которые поддерживают работоспособность криобанка в автономном режиме на длительный срок на исключительный случай перебоев с электричеством.

Криопротокол в ЭКО

Протокол ЭКО, в котором переносится эмбрион, прошедший криоконсервацию, называется криопротоколом.

Выбор криопротокола, как метода вспомогательных репродуктивных технологий, осуществляется на основании показаний, репродуктивных целей и пожеланий пациента.

Преимущества криопротокола в ЭКО:

  • невысокая, по сравнению со стандартным протоколом ЭКО, нагрузка на женский организм (нет стимуляции овуляции, и пункции фолликулов под наркозом, меньше воздействие медикаментозных препаратов)
  • частота наступления беременности выше, чем при стандартном протоколе ЭКО
  • существенно повышаются шансы на наступление беременности после неудачной попытки ЭКО
  • стоимость криопротокола меньше
  • есть возможность выбора временного промежутка, в котором в эндометрии создаются оптимальные условия для успешной имплантации эмбриона – так называемого, «окна имплантации»
  • позволяет отложить рождение детей на более поздний срок

Криоконсервациия яйцеклеток и сперматозоидов

Как известно, с возрастом снижается качество и количество половых клеток.

Поэтому уже сейчас многие задумываются о будущем и используют возможности современных технологий, сохраняя свои половые клетки. Это позволяет выстроить свои репродуктивные планы и запланировать беременность и рождение здорового малыша в более позднем возрасте благодаря использованию в цикле ЭКО своих «молодых» репродуктивных клеток.

Криоконсервация сперматозоидов и яйцеклеток особенно важна для пациентов, которым предстоит курс химиотерапии.

Ознакомиться с ценами на услуги эмбриологии и криоконсервации в Клинике Доктора Фомина можно здесь.

Сравнение результативности переносов эмбрионов на 5-е и 6-е сутки развития в свежих циклах или криопротоколах ЭКО

Развитие методов культивирования эмбрионов, а также широкое распространение витрификации привели к преимущественному культивированию эмбрионов до стадии бластоцисты и переносу одного эмбриона в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Большинство данных показывают максимальную результативность при переносе экспандированных бластоцист на 5-е сутки [1—3], однако не все эмбрионы имеют одинаковые темпы развития: часть эмбрионов останавливается в развитии, другие могут достигать стадии экспандированной бластоцисты к 6-м суткам культивирования. Данные литературы [4, 5] показывают, что около 30% эмбрионов имеют задержку в развитии. Замедленное достижение эмбрионами стадии бластоцисты может быть связано с несколькими причинами: это нарушения в самом эмбрионе и нарушения условий культивирования. Снижение эффективности при переносе эмбрионов на 6-е сутки развития может быть также связано с истощением питательных веществ культуральных сред.

В отсутствие экспандированных бластоцист к 5-м суткам развития признаны возможными две тактики выполнения протокола ЭКО: культивирование эмбрионов до 6 суток с последующей криоконсервацией и переносом в криопротоколе или перенос экспандированной бластоцисты в свежем цикле на 6-е сутки [6, 7].

Стимуляция яичников приводит к некоторым изменениям эндометрия, которые пагубно влияют на «окно имплантации». «Окно имплантации» — период развития эндометрия, в котором возможно взаимодействие с трофобластом эмбриона (22—24-й дни менструального цикла при 28-дневном цикле). Негативное воздействие при стимуляции яичников в программах ЭКО характеризуется наличием аномалий эндометрия, а также ускоренным развитием эндометрия, что в свою очередь приводит к раннему закрытию «окна имплантации» [8, 9]. Более поздние исследования также выявили различия в активации и репрессии экспрессии генов (более 300 генов) при стимуляции яичников (хорионический гонадотропин человека (чХГ) + 7 дней) по сравнению с естественным циклом (лютеинизирующий гормон (ЛГ) + 7 дней), оказывающие влияние на «окно имплантации» и рецептивность эндометрия [10].

Таким образом, можно предположить, что асинхронность развития эмбрионов и эндометрия влияют на результативность программ ЭКО при переносе эмбрионов, достигших стадии экспандированной бластоцисты к 6-м суткам [3]. Однако до конца не ясно, связано ли это со снижением восприимчивости эндометрия или с качеством эмбриона, отстающего в развитии [11].

Цель исследования — сравнение частоты наступления беременности (ЧНБ) в программах ЭКО с переносом эмбрионов на 6-е сутки развития в свежих циклах или в криопротоколах, а также сравнение показателей ЧНБ в криопротоколах при переносе бластоцист, замороженных на 5-е или 6-е сутки развития.

Материал и методы

В соответствии с поставленной целью проанализированы результаты программ ЭКО в неселективной популяции у 2169 пациенток с бесплодием в возрасте от 23 до 43 лет в период с 2016 по 2018 г. по показателям ЧНБ: переносы эмбрионов на 5-е сутки развития в свежих циклах (среднее число эмбрионов на перенос 1,5; средний возраст пациенток 33,7 года), в криопротоколах (среднее число эмбрионов на перенос 1,5; средний возраст пациенток 33,8 года). Переносы эмбрионов на 6-е сутки развития в свежих циклах (среднее число эмбрионов на перенос 1,5; средний возраст пациенток 34,2 года), в криопротоколах (среднее число эмбрионов на перенос 1,3; средний возраст пациенток 34,2 года). Перенос эмбрионов осуществляли только в отсутствие каких-либо противопоказаний.

Метод оплодотворения выбирали с учетом истории заболевания пациентки, оплодотворение осуществлялось не позднее чем через 40 ч после введения триггера. Оценка оплодотворения происходила спустя 16—20 ч. Эмбрионы культивировали группами не более 5 эмбрионов в каплях среды («СООК Medical», США) под минеральным маслом. Оценка эмбрионов на 5-е и 6-е сутки производилась с использованием критериев качества Гарднера [12]. В свежих циклах в отсутствие экспандированной бластоцисты эмбрионы оставляли до 6-х суток развития с последующим выбором: перенос или криоконсервация. При этом осуществлялась криоконсервация эмбрионов только хорошего класса (2—6; АА—ВВ) согласно протоколу производителя. Размораживание эмбрионов происходило не позднее чем за 2 ч до переноса эмбрионов в полость матки.

В посттрансферном периоде при расчетах показателей ЧНБ на перенос эмбрионов учитывали только клинически подтвержденную беременность (выявление с помощью УЗИ плодного мешка на 21—28-е сутки после переноса эмбрионов).

Полученные результаты обрабатывали с использованием методов вариационной статистики, представленных в программе Statistica 6.0. Различия частот, анализируемого признака при парных сравнениях, считали статистически значимыми при уровне значимости р<0,05.

Для анализа влияния суток переноса и используемого протокола (свежий цикл, криопротокол), а также влияния этих факторов на ЧНБ использовали логит-модель. Отдельно с помощью критерия χ2 сравнили частоту наступления беременности при разных протоколах для 5- и 6-суточных эмбрионов. Расчеты проводили в программе Statistica 6.0.

Показано отсутствие различий в выборках пациенток по возрастам, а также по количеству эмбрионов на перенос в свежих циклах или криопротоколах, а также пациенток групп с переносом эмбрионов с разным периодом развития (5-е или 6-е сутки).

Перенос эмбрионов в свежих циклах ЭКО в основном осуществлялся на 5-е сутки развития, однако в 5% (n=109) случаев эмбрионы культивировали до 6 сут с последующим переносом или криоконсервацией бластоцист отличного или хорошего качества. При этом у 71 (65%) пациентки на 6-е сутки осуществлялась криоконсервация эмбрионов (табл. 1). Таблица 1. Распределение пациенток с учетом переноса эмбрионов на 5-е или 6-е сутки в свежих циклах или в криопротоколах экстракорпорального оплодотворения

Сравнение результативности переносов эмбрионов на 5-е сутки развития не показало различий в ЧНБ в свежих циклах ЭКО и криопротоколах (43 и 45% соответственно; p=38%). Также показано отсутствие различий в ЧНБ при переносе эмбрионов на 6-е сутки в свежих или криопротоколах (32 и 37% соответственно; p=60%) (см. рисунок). Сравнение частоты наступления беременности при переносе эмбрионов на 5-е или 6-е сутки развития в свежих циклах или в криопротоколах экстракорпорального оплодотворения.

При статистической обработке с использованием критерия χ2 не выявили различий в ЧНБ в свежих циклах ЭКО при переносе 5- или 6-суточных эмбрионов, а также в ЧНБ при использовании криопротоколов с переносом 5- или 6-суточных эмбрионов (см. табл. 1).

Логит-модель (табл. 2) Таблица 2. Результаты построения логит-модели для показателя частоты наступления беременности. Уровень фактора указывает, для какого из вариантов моделировалась вероятность не показала различий между использованием разных протоколов, однако показала краевую значимость эффекта стадии развития эмбрионов на момент переноса (p=5,4%): эмбрионы на 6-е сутки развития имеют более низкие шансы на имплантацию, чем эмбрионы на 5-е сутки развития. Несмотря на отсутствие статистически значимых различий, результаты ЧНБ в абсолютных значениях показывают тенденцию к увеличению ЧНБ при переносе 6-суточных эмбрионов в криопротоколах.

Криоконсервация ооцитов и эмбрионов человека играет все большую роль в программах ЭКО с момента разработки и совершенствования методов витрификации. В прошлом, вероятно, из-за менее оптимальной выживаемости эмбрионов после медленного замораживания протоколы переносов криоконсервированных — размороженных эмбрионов отличались низкими показателями ЧНБ от протоколов со свежими переносами. В настоящее время на фоне улучшенной выживаемости эмбрионов после витрификации эмбрионы все чаще криоконсервируют для облегчения и предотвращения возникновения синдрома гиперстимуляции яичников. Дополнительные причины для замораживания всех эмбрионов включают генетический скрининг / преимплантационную генетическую диагностику, преждевременный рост прогестерона; учитываются и желания пациента. В результате подготовка эндометрия для переноса размороженных эмбрионов должна проводиться более тщательно. В отличие от свежих программ ЭКО криопротоколы позволяют регулировать день переноса [13].

Полученные в данной работе данные о ЧНБ в различных программах ЭКО при переносе 5-суточных эмбрионов совпадают с данными литературы о том, что метод витрификации не оказывает влияния на потенциал эмбриона к имплантации и не снижает вероятность наступления беременности.

Результаты логит-модели показали отсутствие различий между используемыми протоколами, моделирование уровня фактора сутки/протокол также не показало статистически значимых различий. Данная модель продемонстрировала лишь краевую значимость в зависимости от стадии развития эмбрионов. Можно предположить, что именно стадия развития эмбриона, то есть факт достижения стадии бластоцисты, оказывает влияние на ЧНБ. Снижение результативности переносов эмбрионов на 6-е сутки развития в такой ситуации может быть связано с пролонгированным культивированием in vitro, вызывающим незначительную рассинхронизацию между стадией развития эмбриона и состоянием эндометрия. Отсутствие статистически значимых различий между результатами переносов эмбрионов на 5-е и 6-е сутки развития в разных протоколах позволяет предположить, что эмбрион имеет собственный потенциал к имплантации, не зависящий от прочих факторов. Попадая в полость матки в период «имплантационного окна», эмбрион, находящийся на стадии бластоцисты, имеет высокий потенциал имплантации, при этом скорость развития не играет столь существенной роли, как стадия, которая должна быть достигнута эмбрионом. В настоящее время точно не известны причины, по которым эмбрион может достигать стадии бластоцисты в разные сутки развития. Выдвинуто предположение, что достижение стадии бластоцисты на 6-е сутки развития и снижение ЧНБ при переносе 6-суточных эмбрионов может быть обусловлено увеличенным количеством аномальных веретен деления в клетках эмбриона [14]. В то же время некоторые авторы [15] отмечают увеличение анэуплоидных 6-суточных эмбрионов по сравнению с 5-суточными. Возможно, с целью увеличения ЧНБ при наличии только 6-суточных эмбрионов целесообразно проведение генетического скрининга эмбрионов с последующим переносом эуплоидных эмбрионов.

С целью получения статистически значимо различающихся данных необходимо увеличение числа включенных в исследование пациенток, эмбрионы которых имеют тенденцию к медленному развитию, однако при прочих равных условиях и с учетом результатов логит-модели можно предположить, что для увеличения ЧНБ перенос 6-суточных эмбрионов целесообразнее осуществлять в криопротоколе, который позволяет более точно определить период «имплантационного окна» и нивелировать результат возможной рассинхронизации между стадией развития эмбриона и состоянием эндометрия.

Отсутствуют статистически значимые различия в частоте наступления беременности при переносах эмбрионов на 5-е и 6-е сутки развития в свежих циклах и криопротоколах программ экстракорпорального оплодотворения. Эндометриально-эмбриональная синхронизация является важным предиктором наступления беременности. Отсутствие эмбрионов на стадии бластоцисты на 5-е сутки развития является показанием к культивированию до 6-х суток с последующей криоконсервацией эмбрионов на стадии бластоцисты. Приоритетное внимание должно быть направлено на получение эмбрионов пригодного качества на 5-е сутки развития. Для повышения эффективности переноса эмбрионов как на 5-е, так и на 6-е сутки развития необходим контроль наличия «окна имплантации».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — К.К., А.Б.

Сбор и обработка материала — Н.С., Н.Ч., Ц.К., Т.Б.

Статистическая обработка —Н.Ч., Т.Б.

Написание текста — Н.С., Н.Ч.

Редактирование — К.К., Н.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Краснопольская К.В.— член-корр. РАН, д.м.н., проф., ГБУЗ Московской области «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии», руководитель отделения ВТРТ, врач акушер-гинеколог, ООО «Международная клиника «Семья», заместитель генерального директора по медицинской части, ООО «Приор клиника», заместитель генерального директора по медицинской части; e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-1275-9220

Бекетова А.Н. — к.м.н., ГБУЗ Московской области «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии», научный сотрудник, врач акушер-гинеколог, ООО «Международная клиника «Семья», главный врач; e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0003-1415-7351

Сесина Н.И. — ГБУЗ Московской области «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии», эмбриолог, ООО «Международная клиника «Семья», заведующая эмбриологическим отделением; e-mail:[email protected]; https://orcid.org/0000-0001-7357-6682

Чинченко Н.К. — ООО «Международная клиника «Семья», эмбриолог; e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-5552-9302

Конеева Ц.О. — ГБУЗ Московской области «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии», эмбриолог; ООО «Международная клиника «Семья», эмбриолог; e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-1184-4933

Бочарова Т.В. — ГБУЗ Московской области «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии», научный сотрудник; ООО «Приор клиника», эмбриолог; e-mail: [email protected]; https://orcid.org/0000-0002-3747-6067

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Краснопольская К.В., Бекетова А.Н., Сесина Н.И., Чинченко Н.К., Конеева Ц.О., Бочарова Т.В. Сравнение результативности переносов эмбрионов на 5-е и 6-е сутки развития в свежих циклах или криопротоколах экстракорпорального оплодотворения. Проблемы репродукции. 2019;25(5):-91. https://doi.org/10.17116/repro201925051

Автор, ответственный за переписку: Чинченко Н.К. —
e-mail: [email protected]

Вопросы и ответы

Какие анализы необходимо сдать, прежде чем приступить к программе экстракорпорального оплодотворения?

Во время подготовки к программе экстракорпорального оплодотворения Вам понадобятся следующие анализы:

Анализы для мужчины и женщины:

  • Группа крови и резус-фактор
  • СПИД
  • RW (Сифилис)
  • Гепатит В
  • Гепатит С
  • Флюорограма
  • Кариотип крови

(Результаты этих анализов действительны в течение разного времени. Если срок годности Ваших анализов уже прошел, то Вам необходимо будет сдать их еще раз)

Анализы и обследование для женщины:

  • Анализ крови на гормоны («сдается» натощак на 3-6 или 22-24 дни менструального цикла)

    • ФСГ
    • ЛГ
    • Пролактин
    • Тестостерон
    • Эстрадиол
    • Прогестерон
    • Т3
    • Т4
    • ТТГ
    • ДГА-С
    • Инсулин
    • Кортизол
    • АМГ
    • 17-OHP 
  • Анализ мазка из половых путей на флору и скрытые инфекции, передаваемые половым путем.
  • Необходимо сдать мазок на следующие инфекции (по показаниям):

    • хламидиоз
    • уреаплазмоз
    • микоплазмоз
    • цитомегаловирус
    • герпес
    • токсоплазмоз
    • кандидоз
    • гонорея
    • трихомонада

(Анализы на инфекции действительны в течение 3 месяцев. Если срок годности Ваших анализов уже прошел, то Вам необходимо будет обновить их.)

 

(Результаты этих анализов действительны в течение 1 месяца. Если срок годности Ваших анализов уже прошел, то Вам необходимо будет обновить их.)

Женщине в процессе подготовки к беременности обязательно надо будет проконсультироваться с терапевтом на предмет отсутствия противопоказаний к вынашиванию беременности.

Анализы и обследования для мужчины:

Именно этот анализ во многом решит вопрос о «плодовитости» мужчины. Спермограмма может включать в себя не только стандартные количественные и качественные показатели, но и:

Как необходимо готовиться к двум самым важным процедурам ЭКО: пункции яйцеклеток и переносу эмбрионов?

В день пункции фолликулов женщине категорически запрещается принимать любую пищу и пить жидкость с определенного времени, которое точно Вам скажет только врач с учетом времени пункции. Мужчину в этот же день пригласят в Клинику примерно на час-полтора позже. К этому времени яйцеклетки женщины уже будут готовы для оплодотворения сперматозоидами мужа. Пункция или забор яйцеклеток из организма женщины в Клинике  происходит в утреннее время. С собой Вам необходимо будет взять халат, футболку, носки и тапочки. Клетки получают под кратковременным наркозом. Его длительность не превышает 2-15 минут, чего вполне достаточно для извлечения яйцеклеток. Перед уходом из Клиники необходимо будет получить письменные рекомендации лечащего врача.

Мужчине перед пункцией за 1-2 дня рекомендуется воздержание от половой жизни и алкоголя, если только не назначены лечащим врачом другие сроки воздержания и специальная подготовка.

В день пункции фолликулов у жены, мужу утром надо вымыть пенис (особенно головку) с детским или другим мылом, желательно без сильных ароматических добавок. Надеть чистое нижнее белье. При сборе спермы в специальную стерильную посуду, маркированную Вашей фамилией, именем, отчеством, желательно не касаться ее внутренней поверхности. Если часть эякулята при сдаче спермы была «утеряна», об этом обязательно следует проинформировать лечащего врача.

В день переноса эмбрионов женщине вовсе не надо блюсти такой же строгий режим. Разрешается и есть и пить. С собой Вам так же необходимо будет взять халат, футболку, носки и тапочки.

Проводится ли процедура пункции яйцеклеток и переноса эмбрионов в выходные и праздничные дни?

В Клинике пункция яйцеклеток и перенос эмбрионов проводится тогда, когда это необходимо пациентке. Выходные и праздничные дни на осуществление этих процедур никак не влияют. Если пункция или перенос яйцеклеток совпадают с выходными днями, то Ваш дежурный врач, а так же весь медицинский персонал, обязательно будут присутствовать в Клинике.

Как можно улучшить показатели спермограммы мужа?

Во-первых, по одной спермограмме о способности к оплодотворению судить нельзя. Точно сперма оценивается при наличии нескольких спермограмм, сданных после 3-5 дней воздержания от половой жизни и алкоголя. Увеличение интервала воздержания способствует увеличению количества спермы и концентрацией сперматозоидов, но в тоже время приводит к увеличению патологических форм и снижению подвижности. Рекомендации: необходимо устранить производственные и бытовые вредные факторы, которые могут оказывать отрицательное влияние на мужскую репродуктивную систему, наладить нормальный ритм труда и отдыха, полноценное адекватное питание, обеспечить лечение сопутствующих заболеваний, наладить правильный ритм половой жизни. К производственным вредным факторам, в первую очередь, относят ионизирующее излучение, высокую температуру, например при работе в горячих цехах, вибрацию, токсические вещества, такие как углеводороды и тяжелые металлы; к бытовым — табакокурение, алкоголь, наркотики, злоупотребление сауной. Полезно ежедневно заниматься физической гимнастикой с акцентом на упражнения, улучшающие работу мышц таза и брюшного пресса.

Можно ли заниматься сексом во время лечения методом ЭКО?

В принципе да. Но на последних этапах лечения, перед пункцией за 3-4 дня желательно от секса воздержаться. Это необходимо для того, чтобы по причине механических воздействий не произошла самопроизвольная овуляция.

Сколько по времени длится все лечение методом ЭКО?

В среднем длительность лечения методом ЭКО составляет около месяца. На протяжении этого месяца Вы должны будете регулярно посещать Клинику для УЗИ контроля роста фолликулов и гормональных анализов. Точное время посещения Вы должны будете согласовать с регистратурой Клиники.

Существуют две разновидности ЭКО-программ: короткий и длинный протокол. Чем отличаются эти программы, и какие существуют показания для выбора определенной программы?

Гормональная стимуляция яичников в цикле лечения методом ЭКО проводится для получения сразу нескольких зрелых яйцеклеток на протяжении одного менструального цикла. Это позволяет получить несколько эмбрионов, выбрать лучшие из них для переноса в матку женщины и повысить вероятность наступления беременности в программе ЭКО. В некоторых случаях употребляется схема с получением одного фолликула в естественном цикле.

Чаще всего применяются «короткий», «супердлинный» и «длинный» протоколы лечения методом ЭКО. Протокол называется длинным, потому что начинается с 21 дня менструального цикла, предшествующего стимуляции. Сначала вводится аналог гонадолиберина. Чтобы временно заблокировать работу собственного организма, требуется его введение в ежедневной форме на протяжении не менее 15 дней или одна инъекция большой дозы препарата. После достижения блокады гипофиза наступает менструация, и со 2-3 ее дня начинается стимуляция препаратами, содержащими ФСГ.

Когда стимуляция начинается со 2-3 дня менструального цикла путем ежедневного введения препаратов, содержащих ФСГ, то протокол называется «коротким».

Очень важно, чтобы пациенты строго выполняли указания врачей. Нарушения могут привести к осложнениям, поэтому проводится регулярный гормональный и ультразвуковой мониторинг. Выбор той или иной схемы зависит только от состояния организма и выбирается лечащим врачом.

Можно ли совмещать лечение методом ЭКО с работой?

Да, можно. Вовсе не обязательно брать отпуск на время лечения методом ЭКО. Хотя конечно это ни в коем случае не противопоказано. Вам необходимо будет лишь раз в двое-трое суток приезжать в Клинику на прием к врачу-репродуктологу. Причем прием может проходить как в утренние часы, так и в вечерние. Все зависит от расписания. В дни пункции яйцеклеток и переноса эмбрионов Вы должны будете находиться в Клинике примерно 2-3 часа.

Как производится оплата процедуры ЭКО?

В Клинике оплата процедуры ЭКО производится до пункции фолликулов.  Оплата производится как по наличному, так и по безналичному расчету. На все проплаты выдаются бухгалтерские документы. 

Морозильные камеры (общие) — Allevi

Обзор

Замораживание клеток — полезный шаг для продления срока использования партии клеток. Это общий протокол для замораживания клеток, который не сопровождает протокол производителя. Обратите внимание, что несоблюдение инструкций производителя может привести к гибели клеток или неправильной работе.

Материалы

Методы для морозильных камер (общие)
  1. Нагрейте клеточную среду и реагенты ReagentPack™ до 37°C в ванне с водой/шариками;
  2. Разморозьте среду для замораживания клеток (обычно состоящую из 10% стерильного ДМСО в FBS) и храните ее при температуре 2–8°C до использования;
  3. Не забудьте обрызгать все 70% этанолом и протереть салфетками Kimwipes перед перемещением в BSC;
  4. Следуйте этому протоколу для приготовления клеточного осадка и этому протоколу для подсчета ваших клеток;
  5. Теперь, когда вы подсчитали свои клетки и поместили клеточный раствор в центрифужную пробирку, отцентрифугируйте их при 100–200 g в течение 5–10 минут;
    • Примечание: разные типы клеток будут иметь разные параметры центрифугирования.
  6. Найдите количество раствора для замораживания клеток и флаконов для криогенных клеток, необходимых для ваших флаконов с клетками, используя приведенные ниже формулы. Рекомендуется хранить от 1 до 10 миллионов клеток на флакон, в зависимости от типа клеток;
    • Количество флаконов = количество клеток/количество клеток во флаконе
    • Объем раствора для замораживания клеток = 1,5 мл * количество флаконов
  7. Ресуспендируйте клетки из центрифужной пробирки в расчетном объеме раствора для замораживания клеток;
  8. Аликвота 1.5 мл клеточного раствора в каждый криогенный флакон;
  9. Убедитесь, что на флаконе имеется соответствующая этикетка с указанием количества клеток, номера пассажа (P + 1), типа клетки и даты;
  10. Поместите флаконы с клетками в контейнер для замораживания клеток и переместите его в морозильную камеру с температурой -80°C. Этот шаг важен для обеспечения постепенного снижения температуры клеток, что поддерживает их жизнеспособность;
  11. Через 24 часа при температуре -80°C достаньте флаконы с клетками из контейнера для замораживания клеток и поместите их в жидкий азот;
  12. Рекомендуется вести электронную таблицу журнала клеток с указанием типов клеток, количества пассажей, дат замораживания и количества клеток на контейнер с жидким азотом.Таким образом, вы можете легко получить доступ к своим ячейкам, если это необходимо для ваших экспериментов.

Протокол WIF-B: сохранение (замораживание ячеек)

Протокол WIF-B: сохранение (замораживание ячеек)

| Публикации | Культуральная среда: Текущая | Культуральная среда: старая | Условия культуры | Рецепты: Текущие | Рецепты: Старый | Размораживание клеток | Клетка Характеристики | Субкультура: Текущая | Субкультура: Старый | Контроль качества | Протоколы Cell IMF | консервация (замораживание клеток) | Доставка ДНК |

Консервация (замораживание клеток)

Материалы:

  • Средний (с 15% FBS)
  • ДМСО (конечная концентрация 10% по объему)
  • 1.8 мл стерильная криопробирка (Nunc #3-66656)
  • Морозильный контейнер Cryo 1 (криогенный морозильный контейнер с регулируемой скоростью), Nalgene (номер по каталогу VWR 55710-200) или (номер по каталогу Fisher 15-350-50)

Протокол:

  1. Обновление (смена среды) клеток за 24 часа до замораживания. Ячейки должны быть здоровым и на краю слияния во время замерзания. Они также должны иметь многие митозы очевидны при фазовой микроскопии (~ 8-й день размножения).
  2. Трипсинизируйте клетки, как описано в методах пересева.Считать клетки и определить количество замораживаемых клеток на флакон (хорошее количество клеток на флакон от 1 до 5 x 10 6 ).
  3. После сбора клеток, как описано в методах пересева и подсчитывают, затем клетки следует снова центрифугировать, супернатант аспирируют и клетки ресуспендируют в заданном объеме среды с 15% FBS (объем среды, в которой ресуспендированы клетки, определяется следующим образом: 0,45 мл среды x флаконы для замораживания).Это должно быть выполнено в акции Аккуратно пипетки клеточной суспензии вверх и вниз несколько раз.
  4. Медленно (по каплям) добавьте заданный объем ДМСО в пробирку с исходным раствором (50 м л ДМСО x флаконы для замораживания = 10% об./об. ДМСО), осторожно перемешивая приостановка.
  5. Поместите аликвоты по 0,5 мл в криопробирки с указанием типа клеток, пассаж номер, дата, количество ячеек и инициалы.
  6. Перенесите флаконы в криоконтейнер для замораживания 1 и поместите в -80 C морозильник на ночь.Скорость замораживания до приблизительно 1 /мин.
  7. Перенесите флакон в жидкий азот и запишите место, а также все другие информация на флаконе.

Альтернативный протокол:

  1. Обновление (смена среды) клеток за 24 часа до замораживания. Ячейки должны быть здоровым и на краю слияния во время замерзания. Они также должны иметь много митозов, выявляемых при фазовой микроскопии.
  2. Трипсинизируйте клетки, как описано в методах пересева.Считать клетки и определить количество замораживаемых клеток на флакон (хорошее количество клеток на флакон от 1 до 5 x 10 6 ).
  3. Ресуспендируйте клетки в соответствующем объеме среды для замораживания (90% среды с 15% ФБС; 10% ДМСО). Пожалуйста, работайте быстро после ресуспендирования клеток в Замораживающая среда, ДМСО токсичен для клеток.
  4. Место 0,5 1 мл/криопробирка (10 6 клеток) с указанием типа клеток, пассаж номер, дата, количество ячеек и инициалы.
  5. Перенесите флаконы в контейнер для замораживания Cryo 1 (криогенный контроль). контейнер для замораживания) и немедленно поместите в морозильную камеру при температуре -80 C на ночь. (скорость замораживания = ~ 1 /мин.).
  6. Перенесите флакон в жидкий азот и запишите место, а также все другие информация на флаконе.

Протокол оптимального замораживания для криоконсервации культивируемых клеток

Замораживание клеток

Замораживание клеток — отличный способ максимизировать исследования с использованием драгоценных клеток для безопасного длительного хранения.Однако без надлежащих методов криоконсервации процесс замораживания может быть довольно травматичным для клеток и может привести к потере жизнеспособности и функциональности клеток после оттаивания. Чтобы устранить эти риски, важно поддерживать последовательный протокол замораживания клеток. Хотя конкретный протокол замораживания может варьироваться в зависимости от типа клетки, ниже приведены общие рекомендации о том, что вам нужно знать для лучшей практики. Ваш поставщик клеточных культур обычно предоставляет конкретную информацию.

Протокол замораживания клеток

Перед началом работы

Всегда носите средства индивидуальной защиты.Всегда используйте асептические методы, стерилизуйте все оборудование и лабораторные материалы, которые вступают в контакт с клетками, и работайте в ламинарном боксе.

Замена среды

Перед замораживанием клетки необходимо центрифугировать, промыть и ресуспендировать в криогенном флаконе с подходящей средой для замораживания, содержащей криозащитный агент, такой как ДМСО или глицерин. Среда для замораживания может варьироваться в зависимости от типа клеток.

Процесс замораживания

Скорость охлаждения во время замораживания может повлиять на результат.Таким образом, клетки должны быть заморожены до -80 ° C в аппарате для замораживания с контролируемой скоростью. Если падение температуры происходит слишком быстро, повышается риск образования внутриклеточного льда, который может физически разорвать клеточную мембрану. Однако, если скорость охлаждения слишком низкая, существует риск химической токсичности из-за более высоких концентраций солей.

Оптимальная скорость замораживания обычно составляет около -1°C/мин, однако оптимальная скорость также может различаться для разных типов клеток в зависимости от нескольких факторов, таких как проницаемость мембраны и отношение поверхности к объему.В конечном счете, оптимальную скорость можно определить эмпирическим путем и последовательно проводить с помощью морозильной камеры с регулируемой скоростью. Некоторым морозильникам с регулируемой скоростью требуется жидкий азот, с которым может быть сложно работать, а также существует риск заражения микоплазмой. Варианты без жидкого азота, такие как морозильник Strex CytoSensei Controlled Rate Freezer, могут быть удобным инструментом для замораживания клеток.

В качестве альтернативы криопробирки с клетками можно поместить в камеру с изопропанолом или изолирующей пеной и оставить на ночь в морозильной камере при температуре -80°C.Спиртовая камера или изолирующая пена пытаются оценить скорость замерзания -1°C/мин за счет замедления теплопередачи, но этот метод часто приводит к противоречивым результатам.

Хранение

После замораживания криогенные флаконы с клетками быстро переносят в морозильную камеру при температуре -80°C или в жидкий азот. Флаконы можно переносить на сухой лед, так как клеточные суспензии быстро оттаивают при комнатной температуре.

Протокол криоконсервации CryoStor — РЕКЛАМА

1. Подготовка клеток к криоконсервации

  1. Для подготовки к криоконсервации поместите клетки в суспензию путем механической или ферментативной диссоциации.
  2. Затем отцентрифугируйте клетки, чтобы получить клеточный осадок.
  3. После центрифугирования удалите как можно больше супернатанта культуральной среды, чтобы уменьшить разбавление раствора CryoStor, который будет добавлен на следующем этапе.
  4. Перед тем, как открыть бутыль с холодным раствором CryoStor, протрите внешнюю поверхность контейнера 70% этанолом.
  5. ИЗОЛЯЦИЯ: Добавьте холодный CryoStor, чтобы получить концентрацию клеток 0,5-10 x 10 6 клеток/мл.
  6. ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ЗАМОРОЗКА: Инкубируйте клеточную суспензию при 2-8°C в течение примерно 10 минут.

2. Замораживание и хранение клеток

  1. Для замораживания большинства клеточных систем млекопитающих используйте стандартный протокол медленного контролируемого охлаждения с устройством для замораживания или контейнером с изопропанолом, предварительно охлажденным до 2–8°C.
  2. НУКЛЕАЦИЯ: Заморозьте образцы при температуре -80°C.
  3. Примерно через 10 мин. при температуре -80°C инициируйте образование кристаллов льда в образце (посев) примерно при -5°C, используя либо программу выброса жидкого азота в морозильной камере с регулируемой скоростью, либо механическое перемешивание (щелчок или постукивание) криопробирки/контейнера для образцов.
  4. Заморозьте клетки на 3-4 часа (для контейнера с изопропанолом).
  5. ХРАНЕНИЕ: Для длительного хранения поместите образцы в жидкий азот при температуре ниже -130°C. Хранение образцов при температуре -80°C рекомендуется только для кратковременного хранения от недель до месяцев.

3. Камеры для оттаивания

  1. Замороженные образцы следует быстро разморозить на водяной бане при температуре 37°C. Аккуратно вращайте образец (образцы), пока весь видимый лед не растает. Приблизительное время оттаивания образца объемом 1 мл в криопробирке составляет примерно 3 минуты.
  2. НЕ допускайте нагревания образца(ов) выше температуры охлаждения (0-10°C). После извлечения из водяной бани криопробирки должны быть прохладными на ощупь.
  3. Немедленно разбавьте смесь клеток/CryoStor культуральной средой при температуре от 20°C до 37°C, используя соотношение разбавления 1:10 или больше между образцом и средой.
  4. Ячейки планшета в соответствующей конфигурации.
  5. Поместите клетки в культуральные условия или немедленно используйте.
  6. Через двадцать четыре часа после оттаивания оцените жизнеспособность клеток.

4. Репрезентативные результаты

  1. Результаты оценки жизнеспособности клеток через 24 часа после оттаивания показаны на рис. 1. Сравните результаты для размороженных клеток с незамороженными контрольными.


Рис. 1. Восстановление фибробластов человека после криоконсервации в традиционной культуральной среде/сыворотке/ДМСО или бессывороточном и не содержащем белков внутриклеточном CryoStor: нормальные кожные фибробласты человека (NHDF) были криоконсервированы в культуральной среде/сыворотке/ ДМСО или в среде для криоконсервации CryoStor. После оттаивания клеткам давали восстановиться в стандартных условиях культивирования (37°C/5%CO 2 /влажный воздух) в среде для роста фибробластов. Клетки анализировали через 24 часа после оттаивания с помощью alamarBlue для надлежащей оценки жизнеспособности клеток после проявления отсроченных процессов гибели клеток, таких как апоптоз и вторичный некроз.

Протоколы медленной заморозки — из новой статьи в журнале Bio Process

В недавней статье о криоконсервации доктора Игоря Каткова, известного специалиста в области криобиологии, оборудование Planer используется для объяснения медленного замораживания.

Д-р Катков подытоживает развитие использования скоростного замораживания, написав: «…..всплеск методов криоконсервации….в 1950-х годах… произвел революцию сначала в животноводстве, а затем и в переливании крови». Ранние попытки были эмпирическими, но «… это изменилось, однако, с уравнениями для равновесного медленного замораживания с минимальным образованием внутриклеточного льда. Благодаря новому подходу Мазур в США и Уилмут в Великобритании смогли криоконсервировать эмбрионы мышей. С тех пор медленное замораживание стало основным направлением современной криобиологии.

Работа Мазура и других в 1960-х годах показала, что для разных типов клеток потребуется собственный оптимальный протокол криоконсервации в зависимости от их свойств и типа используемых криопротекторов.

С надежными современными морозильными камерами с регулируемой скоростью в лаборатории научное обоснование иногда можно считать само собой разумеющимся. Особый интерес для пользователей Planer представляет объяснение Каткова того, что он называет равновесным замораживанием, когда: «…эмбрионам требуется очень медленный темп охлаждения (0,03–1°C/мин), поэтому процесс криоконсервации займет несколько часов. Напротив, для небольших сплюснутых (плоских) эллипсоидов, таких как эритроциты, с отличным соотношением поверхности к площади, которое позволило бы им очень быстро терять воду, оптимальная скорость охлаждения при замерзании будет в диапазоне нескольких тысяч °C. в минуту. Таким образом, если мы рассмотрим промежуточную скорость охлаждения, такую ​​как 10 ° C / мин, то это приведет к очень быстрой гибели ооцитов из-за образования внутриклеточного льда. Но такая же скорость охлаждения слишком мала для эритроцитов, поэтому они погибнут из-за чрезмерной усадки и продолжительной деградации.Однако для лимфоцитов эта скорость была бы оптимальной. “

Он подчеркивает, что комбинация концентрации криопротектора и скорости охлаждения уникальна для определенного типа клеток и, следовательно, часто требует многоступенчатых протоколов. Примером может служить криоконсервация плюрипотентных стволовых клеток человека (чЭСК и ИПСК). «Внедрение протокола многоэтапного охлаждения, ингибиторов Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) в сочетании с замораживанием плюрипотентных стволовых клеток на стадии прикрепления, поскольку они склонны к аноикису (гибель клеток после отделения клеток от внеклеточного матрикса) резко увеличили выживаемость и функциональность плюрипотентных стволовых клеток человека после медленного замораживания.”

Д-р Игорь И. Катков, главный научный сотрудник компании Celltronix, Сан-Диего, Калифорния. Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра. и его статью можно прочитать по адресу
http://www.bioprocessintl.com/multimedia/archive/00232/BPI_A_141204AR06_O_232181a.pdf

Дополнительную информацию о криоконсервации см. в «Current Frontiers in Cryobiology», где Стив Батлер, технический директор Planer, а профессор Дэвид Пегг написал главу.
http://www.intechopen.com/books/current-frontiers-in-cryobiology/precision-in-cryopreservation-equipment-and-control

 

Следите за нами на

https://www.linkedin.com/company/planer-plc/

PRIME PubMed | Крио-сетка: простой альтернативный протокол криоконсервации

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ

Продолжающаяся разработка новых протоколов криоконсервации улучшила посткриогенные показатели успешности для большого разнообразия видов растений.Такие методы, как криопланшет, оказались полезными для упрощения процедуры криоконсервации.

ЦЕЛЬ

В этом исследовании оценивалась практичность полоски сетки из нержавеющей стали (криосетка) для криоконсервации кончиков побегов Anigozanthos viridis.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Кончики побегов A. viridis (Kangaroo Paw) предварительно культивировали на 0,4 М сахарозной среде в течение 48 часов. Предварительно культивированные кончики побегов покрывали 2% раствором альгината и помещали на криосетку (25 х 7 мм, 0.Отверстие 4 мм, проволочная сетка из нержавеющей стали диаметром 0,224 мм). Альгинат помещали на 20 мин в загрузочный раствор, содержащий 100 мМ CaCl2, прикрепляя кончики побегов к криосетке. Затем криосетку переносили в PVS2 на льду на 20, 30 или 40 мин перед погружением криосетки в жидкий азот. Протокол крио-сетки сравнивали с протоколом витрификации капель.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Максимум 83% посткриогенной регенерации был достигнут с криосеткой при воздействии PVS2 в течение 30 мин.Не наблюдалось существенной разницы в посткриогенной регенерации между протоколами криосетки и капельной витрификации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Верхушки побегов Anigozanthos viridis были успешно криоконсервированы с использованием новой криосетки. Таким образом, криосетка представляет собой простую и успешную альтернативу криоконсервации.

Цитирование

Funnekotter, B, et al. «Крио-сетка: простой альтернативный протокол криоконсервации». Cryo Letters, vol. 38, нет.2, 2017, стр. 155-159.

Фуннекоттер Б., Банн Э., Мансера Р.Л. Криосетка: простой альтернативный протокол криоконсервации. Криописьма . 2017;38(2):155-159.

Фуннекоттер Б., Банн Э. и Мансера Р. Л. (2017). Криосетка: простой альтернативный протокол криоконсервации. Cryo Letters , 38 (2), 155-159.

Фуннекоттер Б., Банн Э., Мансера Р.Л. Криосетка: простой альтернативный протокол криоконсервации. Криописьма. 2017 март/апрель;38(2):155-159.PubMed PMID: 28534059.

TY — JOUR T1 — Криосетка: простой альтернативный протокол криоконсервации. AU — Фуннекоттер,Б, AU — Банн, Э, AU — Мансера, R L, PY — 2017/5/24/антрез PY – 24 мая 2017 г./опубликовано КГ – 25 июля 2017 г./медлайн СП — 155 ЭП — 159 JF — Криобуквы Джо — крио письма ВЛ — 38 ИС — 2 N2 — ПРЕДПОСЫЛКИ: Непрерывная разработка новых протоколов криоконсервации улучшила показатели посткриогенного успеха для большого разнообразия видов растений. Такие методы, как криопланшет, оказались полезными для упрощения процедуры криоконсервации.ЦЕЛЬ: В этом исследовании оценивалась практичность полоски сетки из нержавеющей стали (криосетка) для криоконсервации кончиков побегов Anigozanthos viridis. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Кончики побегов A. viridis (лапа кенгуру) предварительно культивировали на среде с 0,4 М сахарозой в течение 48 часов. Предварительно культивированные верхушки побегов покрывали 2% раствором альгината и помещали на криосетку (25×7 мм, апертура 0,4 мм, полоса проволочной сетки из нержавеющей стали диаметром 0,224 мм). Альгинат помещали на 20 мин в загрузочный раствор, содержащий 100 мМ CaCl2, прикрепляя кончики побегов к криосетке.Затем криосетку переносили в PVS2 на льду на 20, 30 или 40 мин перед погружением криосетки в жидкий азот. Протокол крио-сетки сравнивали с протоколом витрификации капель. РЕЗУЛЬТАТЫ: Максимум 83% посткриогенной регенерации был достигнут с криосеткой при воздействии PVS2 в течение 30 мин. Не наблюдалось существенной разницы в посткриогенной регенерации между протоколами криосетки и капельной витрификации. ЗАКЛЮЧЕНИЕ: кончики побегов Anigozanthos viridis были успешно криоконсервированы с использованием новой криосетки.Таким образом, криосетка представляет собой простую и успешную альтернативу криоконсервации. СН — 0143-2044 UR — https://www.unboundmedicine.com/medline/citation/28534059/cryo_mesh:_a_simple_alternative_cryopreservation_protocol_ L2 — https://www.ingentaconnect.com/openurl?genre=article&issn=0143-2044&volume=38&issue=2&spage=155&aulast=Funnekotter ДБ — ПРАЙМ ДП — Свободная медицина Скорая помощь —

Протоколы замораживания и оттаивания жидким азотом — Департамент патологии растений и микробиологии окружающей среды

  1. Подготовьте грибную культуру, выращивая ее на чашке с агаром PDYA в течение 1–2 недель.
  2. Подготовьте контейнер Nalgene Cryo-Freezing, добавив изопропанол, и заполните до 250 мл линии на банке.
  3. В пробирку для хранения Nunc добавьте 0,5 мл стерильного 10% раствора глицерина.
  4. Вырежьте кусочки инокулята пробковым отверстием № 2 в стерильных условиях и добавьте два кусочка мицелия в каждую пробирку Nunc, погруженную в 10% раствор глицерина.
  5. Этикетка с номером и датой с криомаркерами.
  6. Поместите криопробирку в подготовленный контейнер Nalgene Cryo-Freezing, закройте и поместите в морозильную камеру при температуре минус 80°C.Через 4 часа перенесите криопробирку в стеллаж для хранения жидкого азота в морозильной камере для хранения жидкого азота.

Протокол оттаивания

Извлеките криопробирку из морозильной камеры LN Storage, поместите на несколько минут в водяную баню с температурой 35°C. Вылейте размороженную культуру на пластину PDYA. Промаркируйте пластину и положите в небольшой пластиковый пакет. Затем храните при комнатной температуре и под небольшим наклоном, чтобы посевной материал оставался в центре планшета, а жидкость для криогенного хранения находилась на дне планшета. Следите за его ростом и заменой культуры и используйте по мере необходимости.

Криопротекторы: Криопротектор – это вещество, которое используется для защиты биологических тканей от повреждения при замораживании. Обычные криопротекторы включают глицерин и диметилсульфоксид (ДМСО). Оба этих материала являются проникающими криопротекторами при физиологических температурах, а это означает, что они способны проникать через клеточные мембраны в цитоплазму.

Криопротекторы помогают поддерживать осмотическое равновесие во время процесса замораживания и уменьшают повреждение, вызванное образованием внутриклеточных кристаллов льда.Глицерин обычно используется для защиты грибных культур от повреждения морозом. Мы обычно добавляем 1 мл стерильного раствора глицерина (10%) в криопробирки емкостью 1,8 мл, а затем погружаем в раствор несколько (до 6) мицелиальных пробок или икроножных зерен.

10% раствор глицерина: Смешайте 10 мл глицерина с 90 мл дистиллированной воды в колбе на 250 мл.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.

*